摘要
豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 (PRRSV) 即藍耳病病毒，是一個對全球養(yǎng)豬業(yè)有顯著經(jīng)濟影響的病原體。替米考星是從Tylosin B所研發(fā)的新型半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。替米考星可以進入肺泡巨噬細胞 (PAMs) 并抑制豬繁殖與呼吸綜合癥病毒在肺泡巨噬細胞體外復制。為評估替米考星對于控制豬體內(nèi)的繁殖與呼吸綜合癥病毒復制的影響而進行本研究。
我們從臺灣和大陸受 PRRSV 感染的一貫化豬場中分別隨機挑選了40只和635只未斷奶的幼豬。幼豬平均分成兩組，并飼育在相同的豬圈，但分隔為個別的飼養(yǎng)空間。斷奶后持續(xù)給予替米考星 (泰美妙 ® 20% 預混劑, 400 mg/kg) 21天（治療組）。未治療組的幼豬未接受替米考星。
在年齡屆第4,6,8,10和12周時采集血液樣本，以偵測 PRRSV 含量。在8周和10周齡時，比較在臺灣接受替米考星治療的幼豬與未接受治療的幼豬，接受替米考星治療的幼豬的PRRSV 量顯著下降 (P<0.05)。在6,8,10和12周齡時，比較在大陸接受替米考星治療的幼豬與未接受治療的幼豬，接受替米考星治療的幼豬的PRRSV 量顯著下降 (P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明接受替米考星治療的動物不僅有較低的 PRRSV 含量，它們研究期間的日均增重也有所改善。
關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、病毒量、替米考星、體內(nèi)測試
1.引言
豬繁殖與呼吸綜合癥 (PRRS) 是一種重要的豬病，它對大部分產(chǎn)豬國家造成重大的經(jīng)濟損失 (Zimmermanet al., 2012)。20世紀90年代初病毒學家確定了致病原為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 (PRRSV) 。雖然PRRSV已被確認為豬繁殖與呼吸綜合癥的致病原超過20年，但目前的管理策略主要集中在通過接種疫苗預防 PRRSV 感染(Murtaugh & Genzow,2011)。然而現(xiàn)有的減毒活疫苗不足以根除病毒，且不能為免受感染提供完全免疫 (Murtaugh & Genzow,2011)。
在我們過往的研究中，高PRRSV含量的豬只（血清內(nèi)﹥10 4.2 PRRSV genomes/µl）似乎顯示高病毒量與PRDC的存在相關(guān) (Lin,Lin,Hung,Wang,& Chiou, 2013)。這些數(shù)據(jù)表明減低血清內(nèi)的PRRSV含量也許可能預防豬只感染PRRSV后產(chǎn)生臨床病征。許多研究試圖找出體外和體內(nèi)有效對抗PRRSV的治療方法，至今市面上仍沒有有效的藥物可以預防豬只體內(nèi) PRRSV感染。
替米考星是從tylosin B 所研發(fā)的新型半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 (Scorneaux & Shryock,1998)，且針對革蘭氏陽性和部分革蘭氏陰性細菌是一種有效的抗微生物制劑 。一個近期研究顯示替米考星在培養(yǎng)的豬肺泡巨噬細胞中對豬繁殖與呼吸綜合癥病毒復制呈現(xiàn)劑量強烈的抗病毒效果，有劑量依賴的現(xiàn)象 (Du et al., 2011)。實驗中感染PRRSV的豬只以替米考星（放入飼料添加劑）治療，與未接受治療的感染對照組相比，結(jié)果顯示獲替米考星的豬只，他們在淋巴結(jié)肥大、肺病變和病毒血癥等方面的嚴重度下降 (Benfield et al., 2002)。此外，使用體外和體內(nèi)服用替米考星模式系統(tǒng)證明此抗生素具有強效免疫調(diào)節(jié)和抗發(fā)炎效果(Buret,2010;Cao et al.,2006;Ci,Chu,Xiang,Li,&Deng,2011)。
根據(jù)替米考星的抗病毒活性，我們推測在自然感染的豬只中，替米考星可作為PRRSV的抗病毒劑。因此，本研究的目的是評估替米考星對于控制體內(nèi)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒復制的影響。
2.方法
2.1 動物和標本采集以及樣本制備
40只四周齡和635只三周齡未斷奶的幼豬，分別從臺灣和大陸受 PRRSV 感染的一貫化豬場中隨機挑選。兩群豬顯示多數(shù)保育豬在6- 8周齡時易受PRRSV感染（未顯示數(shù)據(jù)）。幼豬隨機平均分成兩組，并飼育在相同的豬圈，但分隔為個別的空間。實驗期間豬只可自由攝食及飲水。治療組的幼豬斷奶后開始連續(xù)3周以替米考星(2 mg/kg,泰美妙® 20%預混劑,比利時浩衛(wèi)制藥股份有限公司)飼育。
未治療組的幼豬與治療組接受相同飼育方法，但飼料中沒有加入替米考星，作為對照組。臺灣的實驗中，所有幼豬在4周齡和12周齡時進行稱重。臺灣與大陸實驗于4,6,8,10和12周齡采集豬只血液樣本。血清經(jīng)過分離并儲存于-80°C的溫度，供后續(xù)病毒 RNA 測定用。
2.2 實時聚合酶連鎖反應(Real-Time PCR)(試劑盒及實驗步驟略)
所有來自臺灣和大陸的樣本，分別在臺灣國立屏東科技大學和大陸華南農(nóng)業(yè)大學進行分析。
2.3 ELISA
在臺灣實驗中，針對治療組與未治療組的幼豬，在4,6,8,10和12周齡時采集豬只血液樣本，根據(jù)制造商說明，使用 HerdChek PRRS X3 病毒抗體檢測試劑盒 (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, USA)，偵測特定抗PRRSV抗體。假如ELISA樣本陽轉(zhuǎn)率 (S/P) 低于0.4，則被認定抗PRRSV抗體不存在。
2.4 統(tǒng)計分析
使用學生t-檢定比較治療組與未治療組之間，不同時間點的病毒量。使用卡方檢定 (Chi-square Test) 評估治療組和未治療組之間存活率的差異。P 值 < 0.05 和 < 0.001 分別視為顯著與高度顯著。
3.結(jié)果
3.1 PRRSV 檢出率
臺灣實驗期間（4到12周齡），我們使用未治療組與治療組采集的血清進行PRRSV存在檢測。如實時聚合酶連鎖反應測定，在臺灣，未治療組的93個樣本中，有31個(33.3%) 呈現(xiàn)陽性反應，而治療組的96個樣本中有30個(31.3%) 呈現(xiàn)陽性反應（表 1）。我們計算了未治療組與治療組之間 PRRSV檢出率的相關(guān)性。在兩個實驗之間進行分析，每個時間點針對PRRSV的陽性結(jié)果并未顯示與替米考星治療有顯著相關(guān)（表 1）。
3.2 不同時間點PRRSV量的評估
不同時間點PRRSV量的評估顯示臺灣樣本中，未治療組的PRRSV量(范圍從1.96至5.19 log10 PRRSVgenomes/µl, 平均值3.17 log10）顯著高于(P = 0.0003) 治療組(范圍從 1.25至3.73 log10 PRRSV genomes/µl,平均值2.50 log 10）（表 1）。在大陸實驗的樣本中我們也觀察到相似結(jié)果，未治療組的PRRSV量 (范圍從0.15至5.84 log 10 PRRSV genomes/µl, 平均值2.66 log 10 }）顯著高于 (P = 6.86E-07) 治療組(范圍從0.86至3.95 log 10 PRRSV genomes/µl, 平均值 2.11 log 10 ）（表 1）。測試期間在所有時間點兩組的樣本都偵測到PRRSV病毒血癥，除了4周齡以外（臺灣實驗的所有樣本均呈陰性），治療組每個時間點的平均PRRSV 核酸復制量均低于未治療組，臺灣組在8周齡 (P = 0.027) 與10周齡 (P = 0.007)時觀察到顯著差異（圖 1）。在大陸進行的實驗也獲得相似結(jié)果，4周齡除外。治療組在每個時間點的平均 PRRSV 核酸復制量均低于未治療組，在6周齡 (P = 0.014)、8周齡 (P = 0.006)、10周齡 (P = 0.006) 與 12周齡 (P = 0.001)觀察到顯著差異（圖 2），接受替米考星治療的幼豬，其于不同時間點的最大和最小復制量始終低于未接受治療的幼豬（圖 1 和圖 2）。
3.3 臺灣實驗中 PRRSV 抗體的測量
ELISA結(jié)果顯示，兩組幼豬在6周齡時有最低的 S/P 比，從8到12周齡后持續(xù)增加。兩組之間的差異未有統(tǒng)計意義（圖 3）。
3.4 臺灣實驗中日增重評估
為了評估兩組中給予替米考星對日均增重的影響，所有幼豬在4周齡與12周齡時進行秤重。治療組和未治療組日均增重分別為0.45±0.13kg和0.48±0.08 kg（表 2）。治療組幼豬的日均增重些微高于未治療組，但兩組之間不存在統(tǒng)計差異。

表 1. 臺灣和大陸未治療組與治療組所采集的血清中，PRRSV量結(jié)果的數(shù)目和概述

注釋：1) 每微升血清中Log 10 復制量；** 未治療組與治療組之間存在高度顯著差異。

表 2. 在 4 周齡與 12 周齡時，兩組豬只日均增重 (ADWG) 和平均體重

注釋： 1) 表中所顯示的數(shù)據(jù)單位為公斤； 2) 數(shù)據(jù)以平均值 ± 標準偏差（數(shù)字）顯示。
4.討論
現(xiàn)有的減毒活疫苗不足以根除病毒，且未提供完全免受感染的免疫力 (Murtaugh & Genzow, 2011)。因此，有效的輔助策略應包含抗病毒藥物以及免疫調(diào)節(jié)治療。評估替米考星對抗 PRRSV 抗病毒效果時，我們的數(shù)據(jù)顯示替米考星能有效降低體內(nèi) PRRSV 量。替米考星是從tylosin B所研發(fā)的新型半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有強效免疫調(diào)節(jié)和抗發(fā)炎作用 (Buret, 2010; Cao et al., 2006; Ci et al., 2011)。替米考星被研發(fā)作為豬只預混飼料配方的動物用藥，且被視為能有效對抗幾種豬呼吸病原體的藥物 (DeRosa et al., 2000; Fittipaldi et al., 2005;Shryock et al., 2002; Thacker et al., 2001)。
Benfieldet al. (2002) 指出替米考星可以降低實驗中感染PRRSV豬只的淋巴結(jié)肥大、肺病變和病毒血癥等方面的嚴重度。本研究是首個證實在臺灣和大陸自然感染的豬只中，替米考星能降低血清中PRRSV量的研究。
先前研究中，學者曾提議血清 10 4.2 PRRSV genomes/µl作為豬只有PRDC的閾值 (Lin et al., 2013)。與未治療組相比，以替米考星治療的幼豬，它們在每個時間點的PRRSV病毒血癥發(fā)生率都有所下降。有趣的是，治療組的幼豬沒有一只任何一只幼豬血清中病毒量達到10 4.2PRRSV genomes/µl（圖 1 和圖 2）。這些數(shù)據(jù)表示替米考星可能可以防止自然感染PRRSV的豬只罹患PRDC。
總括而言，我們證實了無論單獨使用替米考星還是與其它疫苗模型結(jié)合均可在受感染的動物中顯著降低病毒血癥，進而提升受PRRSV感染豬只的日均增重。
作者：Chao-Nan Lin,Yu-Jian Yyang,Wei-Hao Lin,Hsien-Ching Wu,Zhixuan Xiong,Wouter Depondt,Alain Kanora,Min Cui,Danping Su,DongSheng He & Ming-Tang Chiou.

                                               李永濤